食品安全國家標準
食品中脂肪酸的測定
GB5009.168—2016
概述
脂肪酸介紹
? 大部構(gòu)成食物的脂肪和動物體脂主要以甘油三酯為其基本結(jié)構(gòu)， 甘油三脂實質(zhì)上就是一分子甘油與三分子脂肪酸所形成的酯， 構(gòu)成三個分子脂肪酸的種類很多， 目前已知存在于自然界的脂肪酸有40多種。
? 脂肪酸的命名和表示方式可以簡化為碳的數(shù)目與不飽和鍵的數(shù)目， 例如棕櫚酸為16個碳的飽和脂肪酸， 其中沒有不飽和鍵，故以16：0表示，而油酸含有18個碳和一個不飽和鍵（一個烯），以18∶1表示，故棕櫚酸的式列應(yīng)為：
? 16 4 3 2 1
? CH3[CH2]11·CH2·CH2·CH2·COOH
? ω g b a
? 脂肪酸碳原子位置的排列名稱也統(tǒng)一為上述的分子式
前言
本標準代替GB/T 5009.168—2003《食品中二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的測定》 、 GB/T22223—2008《食品中總脂肪、 飽和脂肪(酸)、 不飽和脂肪(酸)的測定 水解提取-氣相色譜法》 、 GB5413.27—2010《食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中脂肪酸的測定》 、GB/T9695.2—2008《肉與肉制品 脂肪酸測定》 、GB/T17376—2008《動植物油脂 脂肪酸甲酯制備》 、GB/T17377—2008《動植物油脂 脂肪酸甲酯的氣相色譜分析》 、 SN/T2922—2011《出口食品中EPA 和DHA 的測定 氣相色譜法》 、 NY/T91—1988《油菜籽中油的芥酸的測定 氣相色譜法》 。
? 本標準與GB/T5009.168—2003相比,主要變化如下:
? —標準名稱修改為“食品安全國家標準 食品中脂肪酸的測定”
? —增加了內(nèi)標法和歸一化法
? —修改了原標準中的色譜柱,將玻璃柱改為毛細管色譜柱
1 范圍
? 本標準規(guī)定了食品中脂肪酸含量的測定方法
? 本標準適用于食品中總脂肪、 飽和脂肪(酸)、不飽和脂肪(酸)的測定；
?本標準中水解-提取法適用于食品中脂肪酸含量的測定；
?酯交換法適用于游離脂肪酸含量不大于2%的油脂樣品的脂肪酸含量測定；
?乙酰氯-甲醇法適用于含水量小于5%的乳粉和無水奶油樣品的脂肪酸含量測定。
第一法 內(nèi)標法
? 2 原理
? 2.1 水解-提取法
? 加入內(nèi)標物的試樣經(jīng)水解-乙醚溶液提取其中的脂肪后,在堿性條件下皂化和甲酯化,生成脂肪酸甲酯,經(jīng)毛細管柱氣相色譜分析,內(nèi)標法定量測定脂肪酸甲酯含量。
? 依據(jù)各種脂肪酸甲酯含量和轉(zhuǎn)換系數(shù)計算出總脂肪、 飽和脂肪(酸)、 單不飽和脂肪(酸)、 多不飽和脂肪(酸)含量。動植物油脂試樣不經(jīng)脂肪提取,加入內(nèi)標物后直接進行皂化和脂肪酸甲酯化。
? 2.2 酯交換法(適用于游離脂肪酸含量不大于2%的油脂):將油脂溶解在異辛烷中,加入內(nèi)標物后,加入氫氧化鉀甲醇溶液通過酯交換甲酯化，反應(yīng)完全后,用硫酸氫鈉中和剩余氫氧化鉀,以避免甲酯皂化。
3 主要試劑和材料
? 3.1.3 焦性沒食子酸(C6H6O3)。
? 3.1.4 乙醚(C 4 H 10 O)。
? 3.1.5 石油醚:沸程30℃~60℃；
? 3.1.10 三氟化硼甲醇溶液,濃度為15%；
? 3.3.1 十一碳酸甘油三酯(C 36 H 68 O 6 ,CAS號:13552-80-2)；
? 3.2.1 鹽酸溶液(8.3mol/L):量取250mL鹽酸,用110mL水稀釋,混勻,室溫下可放置2個月；
? 3.2.2 乙醚-石油醚混合液(1+1):取等體積的乙醚和石油醚,混勻備用
? 3.2.3 氫氧化鈉甲醇溶液(2%):取2g氫氧化鈉溶解在100mL甲醇中,混勻；
? 3.2.4 飽和氯化鈉溶液:稱取360g氯化鈉溶解于1.0L水中,攪拌溶解,澄清備用；
? 3.2.5 氫氧化鉀甲醇溶液(2mol/L):將13.1g氫氧化鉀溶于100mL無水甲醇中,可輕微加熱,加入無水硫酸鈉干燥,過濾,即得澄清溶液；
4 分析步驟
4.2 試樣前處理
n 4.2.1 水解-提取法
? 4.2.1.1 試樣的稱取
? 稱取均勻試樣0.1g~10g(精確至0.1mg,約含脂肪100mg~200mg)移入到250mL平底燒瓶中,準確加入2.0mL十一碳酸甘油三酯內(nèi)標溶液，加入約100mg焦性沒食子酸,加入幾粒沸石,再加入2mL95%乙醇和4mL水,混勻，根據(jù)試樣的類別選取相應(yīng)的水解方法,乳制品采用堿
水解法;乳酪采用酸堿水解法;動植物油脂直接進行。
步驟4.2.1.4;其余食品采用酸水解法
? 注:根據(jù)實際工作需要選擇內(nèi)標,對于組分不確定的試樣,第一次檢測時不應(yīng)加內(nèi)標物。 觀察在內(nèi)標物峰位置處是否有干擾峰出現(xiàn),如果存在,可依次選擇十三碳酸甘油三酯或十九碳酸甘油三酯或二十三碳酸甘油三酯作為內(nèi)標；
4.2.1.2 試樣的水解
? 酸水解法:
? 食品(除乳制品和乳酪):加入鹽酸溶液10mL,混勻。 將燒瓶放入70℃~80 ℃水浴中水解40min。 每隔10min振蕩一下燒瓶,使黏附在燒瓶壁上的顆粒物混入溶液中。 水解完成后,取出燒瓶冷卻至室。溫
? 堿水解法:
? 乳制品(乳粉及液態(tài)乳等試樣):加入氨水5mL,混勻。 將燒瓶放入70℃~80℃水浴中水解20min。 每5min振蕩一下燒瓶,使黏附在燒瓶壁上的顆粒物混入溶液中。水解完成后,取出燒瓶冷卻至室溫。
? 酸堿水解法:
? 乳酪:加入氨水5mL,混勻。 將燒瓶放入70 ℃~80 ℃水浴中水解20min。 每隔10min振蕩一下燒瓶,使黏附在燒瓶壁上的顆粒物混入溶液中，接著加入鹽酸10 mL,繼續(xù)水解20min,每10min振蕩一下燒瓶,使黏附在燒瓶壁上的顆粒物混入溶液中。 水解完成后,取出燒瓶冷卻至室溫。
4.2.1.3 脂肪提取
? 水解后的試樣,加入10mL95%乙醇,混勻? 將燒瓶中的水解液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中,用
50mL乙醚石油醚混合液沖洗燒瓶和塞子,沖洗液并入分液漏斗中,加蓋? 振搖5min,靜置10min。 將醚層提取液收集到250mL燒瓶中。 按照以上步驟重復(fù)提取水解液3次,最后用乙醚石油醚混合液沖洗分液漏斗,并收集到250mL燒瓶中? 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干,殘留物為脂肪提取物。
4.2.1.4 脂肪的皂化和脂肪酸的甲酯化
? 在脂肪提取物中加入2%氫氧化鈉甲醇溶液8mL,連接回流冷凝器,80℃±1℃水浴上回流,直至油滴消失，從回流冷凝器上端加入7mL15%三氟化硼甲醇溶液,在80 ℃±1 ℃水浴中繼續(xù)回流2min，用少量水沖洗回流冷凝器，停止加熱,從水浴上取下燒瓶,迅速冷卻至室溫；
? 準確加入10mL~30mL正庚烷,振搖2min,再加入飽和氯化鈉水溶液,靜置分層， 吸取上層正庚烷提取溶液大約5mL,至25mL試管中,加入大約3g~5g無水硫酸鈉,振搖1min,靜置5min，吸取上層溶液到進樣瓶中待測定；
說明
? 目前標準中出現(xiàn)的甲酯化方法包括： 堿性條件下三氟化硼甲醇法， 三甲基氫氧化硫法， 鹽酸甲醇法，其中GB/T 17376中規(guī)定的三種甲酯化方法是等同采用了ISO 5509： 2000《動植物油脂脂肪酸甲酯制備》 ， 其中三甲基氫氧化硫法的甲酯化反應(yīng)是在進樣口中， 于高溫條件下進行， 不推薦使用極性固定相， 與本方法所采用的強極性固定相不匹配， 且在
國標中沒有使用。 參考AOAC和AOCS中普遍使用三氟化硼酯化法， 少數(shù)國內(nèi)標準方法中使用了鹽酸甲醇法， 因此水解提取法中將甲酯化方法統(tǒng)一為應(yīng)用較為普遍的三氟化硼-甲醇法。
4.2.2 酯交換法
? 適用于游離脂肪酸含量不大于2%的油脂樣品
? 4.2.2.1 試樣稱取
?稱取試樣60.0mg至具塞試管中,精確至0.1mg,準確加入2.0mL內(nèi)標溶液；
? 4.2.2.2 甲酯制備
?加入4mL異辛烷溶解試樣,必要時可以微熱使試樣溶解后加入200μL氫氧化鉀甲醇溶液,蓋上玻璃塞猛烈振搖30s后靜置至澄清，加入約1g硫酸氫鈉,猛烈振搖,中和氫氧化鉀，待鹽沉淀后,將上層溶液移至上機瓶中,待測。
4.3.1 色譜參考條件
? 取單個脂肪酸甲酯標準溶液和脂肪酸甲酯混合標準溶液分別注入氣相色譜儀,對色譜峰進行定性。
? a) 毛細管色譜柱:聚二氰丙基硅氧烷強極性固定相,柱長100m,內(nèi)徑0.25mm,膜厚0.2μm
? b) 進樣器溫度:270℃
? c) 氫火焰離子檢測器檢測器溫度:280℃
? d) 程序升溫:初始溫度100℃,持續(xù)13min;100℃~180℃,升溫速率10℃/min,保持6min;180℃~200℃,升溫速率1℃/min,保持20min;200℃~230℃,升溫速率4℃/min,保持10.5min。
? e) 載氣:氮氣
? f) 分流比:100∶ 1
? g) 進樣體積:1.0μL
? h) 檢測條件應(yīng)滿足理論塔板數(shù)(n)至少2000/m,分離度(R)至少1.25；
37種脂肪酸甲酯標準溶液典型參考圖譜
1-37分別對應(yīng)以下:1/C4:0,2/C6:0, 3/C8:0, 4/C10:0, 5/C11:0, 6/C12:0, 7/C13:0,8/C14:0, 9/C14:1, 10/C15:0,11/C15:1,12/C16:0,13/C16:1,15/C17:1,16/C18:0,17/C18:1n9t, 8/C18:1n9c,19/C18:2n6t, 20/C18:2n6c,21/C20:0,22/C18:3n6,23/C20:1,24/C18:3n3,25/C21:0,26/C20:2,27/C22:0,28/C20:3n6,29/C22:1n9,30/C20:3n3,31/C20:/1n6,32/C23:0,33/C22:2,34/C24:0,35/C20:5, 36/C24:1 ,37/C22: 6n3；
5.分析結(jié)果的表述
? 5.1 試樣中單個脂肪酸甲酯含量
? 試樣中單個脂肪酸甲酯含量按式(1)計算:
X i =F i ×（A i /A C11 ）×[ρC11×V C11×1.0067 /m]×100…………(1)
? 式中:
? X i —試樣中脂肪酸甲酯i 含量,單位為克每百克(g/100g)；
? F i —脂肪酸甲酯i 的響應(yīng)因子；
? A i —試樣中脂肪酸甲酯i 的峰面積；
? A C11 —試樣中加入的內(nèi)標物十一碳酸甲酯峰面積；
? ρ C11 —十一碳酸甘油三酯濃度,單位為毫克每毫升(mg/mL)；
? V C11 —試樣中加入十一碳酸甘油三酯體積,單位為毫升(mL)；
? 1.0067—十一碳酸甘油三酯轉(zhuǎn)化成十一碳酸甲酯的轉(zhuǎn)換系數(shù)；
? m —試樣的質(zhì)量,單位為毫克(mg)；
? 100 —將含量轉(zhuǎn)換為每100g試樣中含量的系數(shù)；
5.2 試樣中飽和脂肪(酸)含量
? 脂肪酸甲酯i 的響應(yīng)因子Fi 按式(2)計算:
Fi =ρSi×A11/（ASi×ρ11）………………(2)
? 式中:
? F i —脂肪酸甲酯i 的響應(yīng)因子；
? ρ Si —混標中各脂肪酸甲酯i 的濃度,單位為毫克每毫升(mg/mL)；
? A 11 —十一碳酸甲酯峰面積；
? A Si —脂肪酸甲酯i 的峰面積；
? ρ11———混標中十一碳酸甲酯濃度,單位為毫克每毫升(mg/mL)；
第二法 外標法
6 原理
? 6.1 水解-提取法:試樣經(jīng)水解-乙醚溶液提取其中的脂肪后,在堿性條件下皂化和甲酯化,生成脂肪酸甲酯,經(jīng)毛細管柱氣相色譜分析,外標法定量測定脂肪酸的含量， 動植物純油脂試樣不經(jīng)脂肪提取,直接進行皂化和脂肪酸甲酯化
? 6.2 乙酰氯-甲醇法(適用于含水量小于5%的乳粉和無水奶油試樣):乙酰氯與甲醇反應(yīng)得到的鹽酸-甲醇使其中的脂肪和游離脂肪酸甲酯化,用甲苯提取后,經(jīng)氣相色譜儀分離檢測,外標法定量
? 6.3 酯交換法(適用于游離脂肪酸含量不大于2%的油脂):將油脂溶解在異辛烷中,加入氫氧化鉀甲醇溶液通過酯交換甲酯化,反應(yīng)完全后,用硫酸氫鈉中和剩余氫氧化鉀,外標法定量測定脂肪酸的含量。
7 主要試劑和材料
? 7.2.1 鹽酸溶液(8.3mol/L):同3.2.1
? 7.2.2 乙醚-石油醚混合液(1+1):同3.2.2
? 7.2.3 氫氧化鈉甲醇溶液(2%):同3.2.3
? 7.2.4 飽和氯化鈉溶液:同3.2.4
? 7.2.5 乙酰氯甲醇溶液(體積分數(shù)為10%):量取40 mL甲醇于100 mL 干燥的燒杯中,準確吸取5.0mL乙酰氯逐滴緩慢加入,不斷攪拌,冷卻至室溫后轉(zhuǎn)移并定容至50mL干燥的容量瓶中。 臨用前配制。
? 注:乙酰氯為刺激性試劑,配制乙酰氯甲醇溶液時應(yīng)不斷攪拌防止噴濺,注意防護
? 7.2.6 碳酸鈉溶液(6%):稱取6g無水碳酸鈉于100mL燒杯中,加水溶解,轉(zhuǎn)移并用水定容至100mL容量瓶中；
? 7.2.7 氫氧化鉀甲醇溶液(2mol/L):同3.2.5
8 儀器設(shè)備
? 8.1 勻漿機或?qū)嶒炇矣媒M織粉碎機或研磨機；
? 8.2 氣相色譜儀:具有氫火焰離子檢測器(FID)；
? 8.3 毛細管色譜柱:聚二氰丙基硅氧烷強極性固定相,柱長100m,內(nèi)徑0.25mm,膜厚0.2μm；
? 8.4 恒溫水浴:控溫范圍40℃~100℃,控溫±1℃；
? 8.5 分析天平:感量0.1mg；
? 8.6 離心機:轉(zhuǎn)速≥5000r/min；
? 8.7 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；
? 8.8 螺口玻璃管(帶有聚四氟乙烯做內(nèi)墊的螺口蓋):15mL；
9.2 試樣前處理
9.2.1 水解-提取法
? 9.2.1.1 試樣的稱取
? 稱取均勻試樣0.1g~10g(精確至0.1mg,約含脂肪100mg~200mg)移入到250mL平底燒瓶中,加入約100mg焦性沒食子酸,加入幾粒沸石,再加入2mL95%乙醇,混勻。 根據(jù)試樣的類別選取不同的水解方法。
? 9.2.1.2 試樣的水解
? 操作步驟同4.2.1.2
? 9.2.1.3 脂肪提取
? 操作步驟同4.2.1.3
? 10.2.1.4 脂肪的皂化和脂肪酸的甲酯化
? 操作步驟同4.2.1.4
? 動植物油脂試樣不經(jīng)脂肪提取,直接進行皂化和脂肪酸甲酯化(同4.2.1.4)
9.2.2 乙酰氯-甲醇法
? 9.2.2.1 試樣稱取
? 準確稱取乳粉試樣0.5g或無水奶油試樣0.2g(均精確到0.1mg)于15mL干燥螺口玻璃管中,加入5.0mL甲苯；
? 9.2.2.2 試樣測定液的制備
? 向試樣中加入10%乙酰氯甲醇溶液6mL,充氮氣后,旋緊螺旋蓋，振蕩混合后于80℃±1℃水浴中放置2h,期間每隔20min取出振搖1次,水浴后取出冷卻至室溫，將反應(yīng)后的樣液轉(zhuǎn)移至50mL離心管中,分別用3 mL碳酸鈉溶液清洗玻璃管3 次,合并碳酸鈉溶液于50 mL離心管中,混勻。 5000r/min離心5min? 取上清液作為試液,氣相色譜儀測定；
9.2.3 酯交換法
? 9.2.3.1 試樣稱取
?稱取試樣60.0mg至具塞試管中,精確至0.1mg；
? 9.2.3.2 甲酯制備
?同4.2.2.2
第三法 歸一化法
? 10 原理
? 10.1 水解-提取法:試樣經(jīng)水解-乙醚溶液提取其中的脂肪后,在堿性條件下皂化和甲酯化,生成脂肪酸甲酯,經(jīng)毛細管柱氣相色譜分析,面積歸一化法定量測定脂肪酸百分含量， 動植物油脂試樣不經(jīng)脂肪提取,直接進行皂化和脂肪酸甲酯化；
? 10.2 酯交換法(適用于游離脂肪酸含量不大于2%的油脂):將油脂試樣溶解在異辛烷中,加入氫氧化鉀甲醇溶液通過酯交換甲酯化,反應(yīng)完全后,用硫酸氫鈉中和剩余氫氧化鉀,面積歸一化法定量測定脂肪酸百分含量。
11 分析步驟
? 11.1 試樣的制備
? 操作步驟同4.1
? 11.2 水解-提取法
? 11.2.1 試樣的稱取
? 稱取均勻試樣0.1g~10g(精確至0.1mg,約含脂肪100mg~200mg)移入到250mL平底燒瓶中
? 加入約100mg焦性沒食子酸,加入幾粒沸石,再加入2mL95%乙醇,混勻，根據(jù)試樣的類別選取不同的水解方法。
? 11.2.2 試樣的水解
? 操作步驟同4.2.1.2
? 11.2.3 脂肪提取
? 操作步驟同4.2.1.3
? 11.2.4 脂肪的皂化和脂肪酸的甲酯化
? 操作步驟同4.2.1.4
? 11.2.5 色譜測定
? 色譜參考條件同4.3.1
? 11.3 酯交換法
? 11.3.1 試樣稱取
? 稱取試樣60.0mg至具塞試管中,精確至0.1mg；
? 11.3.2 甲酯制備
? 同4.2.2.2
三、儀器及材料
1．氣相色譜儀GC 7900（AFC） （南京科捷檢測）
氫焰檢測器（FID）
氣源： 氮氣，氫氣，空氣。
2．數(shù)據(jù)處理：N2000工作站及電腦
3．色譜柱：毛細管專用柱 。
4．分析級：乙醚，正己烷，甲醇，kOH（NaOH），蒸餾水
5．10ml容量瓶
GC 7900（AFC） 氣相色譜儀
GC 7900 氣相色譜儀，擁有成熟穩(wěn)定的技術(shù) , 主要應(yīng)用于環(huán)境科學(xué)、食品安全、石油化工、精細化工、電子高純氣體 等行業(yè)，適用于科研院所、質(zhì)檢、安監(jiān)、公安法醫(yī)和國家安全等領(lǐng)域的分析檢測。
性能特點：
● 高精度氣體流量控制系統(tǒng)（AFC）
1·采用 AFC 數(shù)字化控制技術(shù)，自動化水平和整體性能接近國際一線品牌
2·高精度氣體流量控制，確保 GC 分析的準確度，提高日常分析效率，AFC 控制精度 0.01psi
3·實現(xiàn)了氣路故障自我保護、自動點火、熄火重點、自動開啟氣路等功能，從而達到了一鍵啟動
4·多種控制組合模式操作，壓力流量全自動調(diào)節(jié)、控制和顯示，可運行省氣模式
● 彩色寬屏，觸摸按鍵的獨特設(shè)計
1·采用 7 寸工業(yè)彩色液晶屏設(shè)計，顯示信息更全，界面操作更合理
2·具有中 / 英文兩套操作系統(tǒng)，滿足不同的用戶需求
3·采用電阻式觸摸屏，手感好、經(jīng)久耐用、屏幕和軟件雙操作實現(xiàn)無縫連接
● 領(lǐng)先的結(jié)構(gòu)設(shè)計
1·模塊化的結(jié)構(gòu)設(shè)計，便于升級?？蛇x配多種高性能檢測器，如 FID、TCD、ECD、FPD 和 NPD 等，滿足多種類樣品的 分析需求
2·先進的進樣器設(shè)計，獨特的內(nèi)襯管結(jié)構(gòu)和特殊處理工藝，確保樣品零吸附
3·適配多種進樣方式，頂空進樣器、熱解析儀、液體自動進樣器，輕松勝任各種樣品類型的分析
4·設(shè)計定時自啟動程序，可輕松的完成氣體、液體樣品的實驗室在線分析
● 極具用戶體驗的軟件操作系統(tǒng)
1·采用先進的 10/100M 自適用以太網(wǎng)通信接口，內(nèi)置 IP 協(xié)議，輕松組成局域網(wǎng)，實現(xiàn)遠距離傳輸、遠程控制、遠程診斷
2·界面簡單，數(shù)據(jù)處理功能強大，實現(xiàn)了 GC 整套分析管理工作的嚴謹和高效自動化
3·配備 IBrainChrom 工作站，可支持多臺色譜儀（253 臺）同時工作，實現(xiàn)數(shù)據(jù)處理及反控
關(guān)于南京科捷
南京科捷檢測科技發(fā)展有限公司作為實驗室色譜領(lǐng)域的知名企業(yè)，在近 20年的技術(shù)創(chuàng)新歷史中，一直致力于幫助科學(xué)家和實驗室分析人員解決復(fù)雜的分析問題。
我們?yōu)榭茖W(xué)家和實驗室分析人員在 GC、GCMS、LC、AAS、ICP、UV 等領(lǐng)域提供方案，并在其日常檢測中提供技術(shù)支持，經(jīng)過20年的沉淀與積累，逐漸贏得客戶信賴。
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